结构基因组学

结构基因组学(蛋白质结晶)


蛋白质结晶的概述

获得均匀的单分散的蛋白质和随后的晶体衍射实验足够大的是两个晶体学的最大障碍。12减少蛋白质的用于结晶条件的初步筛选所需要的量是理想的。筛选不稳定膜蛋白和蛋白复合物必须在为了防止内源蛋白酶降解迅速进行纯化时,使用超小的墨滴体积相关联的快速结晶是有利的。3材料,其从降低的采样要求益处包括晶体筛选稳定的蛋白质 - 蛋白质复合物中大量无法实现的,4在细胞培养物表达的重组蛋白,纯化的膜磷脂,和膜蛋白稳定仅在有限的一组洗涤剂(SS-辛基葡糖苷,十二烷基麦芽糖苷,十二烷基二甲基氧化物)。6的速度,小晶体形式可以是不稳定的膜蛋白不能为天保持完整,以执行常规的筛选方法所需周的情况下,很重要的。喷墨技术使用小的液滴,以节省蛋白与高通量分配以增加其在给定时间实验次数提供了执行初始蛋白质结晶筛选实验的机会。小晶体初始喷墨期间实现更迅速地筛选实验可导致研究者以扩大使用常规的蛋白质筛选系统。从最初的结晶筛选成功参数然后可以被用于获得较大的晶体目标衍射研究。利用来自小滴衍生的小晶体的机会正在改善随着技术目前正在开发用于衍射和微晶的结构测定,使用包括微聚焦同步加速器,原子显微镜和nanogravimetry。789

细菌视紫红质的结晶

用于通过Faham开发细菌视紫红质(BR)的修饰bicelle结晶法,等人,10,用滴按需喷墨分配以生成BR的晶体进行。1112Bicelles是由小的双层盘,/,其形成在两亲脂质的混合物。膜蛋白可以被引入到bicelles体验般的环境比在洗涤剂胶束发生什么更双层。13所述bicelle形成脂质/两亲物的混合物是更多的液体在较低的温度(<4℃)并形成凝胶状在较高温度下的一致性。的混合物二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱/磷脂酰胆碱dihexanoyl具有包括在较高温度下被描述为穿孔层状结构互连bicelles的相位。14有可能通过改变脂质/两亲物的混合物的温度以获得各种脂质双层结构。这些材料在低温下的低粘度允许操作使用标准筛选方法。这是不使用的情况下在立方方法15其中立方相是极其粘稠并且将不可能喷墨分配。

BR晶体

2周后BR晶体形成在悬滴蒸气扩散实验,其中的BR溶液100nL是喷墨沉积到脂质bicelle混合物(1.0微克BR /滴)的1.0微升的下降。晶体形态为针/星形。最大晶体尺寸为32微米。

BR晶体

2周后BR晶体形成在悬滴蒸气扩散实验,其中的BR溶液300nL是喷墨沉积到脂质bicelle混合物(3.0微克BR /滴)的1.0微升的下降。晶体形态是菱形星形。最大晶体尺寸为62微米。

BR晶体

2周悬滴蒸气扩散实验,其中的BR溶液1000nL是喷墨沉积到脂质bicelle混合物的1.0微升降(10.0微克BR /滴)后BR晶体形成。最大晶体尺寸为131微米。

BR晶体

左:通过冷却的喷墨设备沉积在1NL降的悬滴蒸气扩散实验期间2周后BR晶体形成(5.0ng BR /滴)BR的/ bicelle结晶溶液。最大结晶粒径为20微米。右:对照样品中BR晶体形态(5.128微克BR /滴)。最大晶体尺寸为121微米。

BR晶体

BR晶体形成在下石蜡油一个微量分批设置。BR / bicelle的300nL印刷成脂滴,随后用沉淀剂(0.6125mM磷酸二氢钠的pH 3.5)的25%的浓度混合。

FEPA的结晶

FEPA是在大肠杆菌的外膜识别铁肠菌素,一个tricatecholate铁载体,以获得在生长培养基中的铁离子的受体蛋白。纯化FEPA来自德克萨斯大学达拉斯西南医学中心的约翰·戴森霍费尔礼物捐赠。16在10毫克的浓度的蛋白/ ml的1:1混合用含有0.1M [N-三(羟甲基)-methylglycine](TRICINE)pH 8.0中结晶溶液,31%(W / V)的PEG 1000,0.35M的NaCl,为2.5mM的CaCl 2,0.055%LDAO,15%甘油和50PL,100pL,150pL,50NL和300nL沉积到玻璃盖玻片上喷墨。贮存溶液含有0.1M甘氨酸pH 8.0中,30%PEG 1000,0.35M的NaCl,0.06%LDAO,在300毫升的在汉普顿研究VDX™悬滴板的体积的10%甘油。上述FEPA结晶溶液也在石蜡油在150nL沉积。在微量分批蒸气扩散筛选实验的沉淀剂溶液含有0.1M甘氨酸pH 8.0中,30%PEG 1000,0.35M的NaCl,0.06%LDAO,10%甘油,并于套印在150nL下石蜡油的FEPA结晶溶液。温育在黑暗中在20℃和37℃。在50PL,100pL三个星期后观察FEPA的晶体和150pL在悬滴蒸气扩散实验在4℃(图片下面)下降。蛋白在滴剂中的浓度分别0.25ng,为0.5ng,每50PL,100pL,和150pL降0.75ng。没有形成晶体已在50NL和300nL悬滴或任何在微量分批实验的液滴的被观察到。谁曾结晶的蛋白质戴森霍弗实验室化验员证实FEPA晶体的形成。

FEPA晶体

FEPA在晶体(左到右)150pL,100pL,50PL和100pL在4三周后温育滴℃。



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